Стенфордское исследование экспрессии генов кожи под воздействием BBL
Исследования, проведенные в Стэндфордском Университете доказали, что:
— под влиянием процедур Forever Young BBL «омолаживается» более 1000 РНК стареющей кожи,
— экспрессия т.е. активность генов клеток становится такой же как и в молодых клетках.
Омоложенные гены участвуют в регуляции таких функций клеток как:
— долголетие
— иммунитет кожи
— длительность жизни фибробластов
— угнетение опухолевых процессов
Это клинически проявляется в:
— увеличении эластичности
— более однородном и упорядоченном распределении коллагена
— коррекции мелких морщин, пигментных пятен и сосудистых
Анализ экспрессии генов
Группа A — стареющая кожа до проведения процедур (старше 50 лет).
Группа B — Forever Young BBL стареющая кожа после 3-х процедур (старше 50 лет)
Группа C — молодая кожа, не подвергавшаяся воздействию BBL (моложе 30 лет)
Стареющая кожа после процедур Forever Young BBL показала изменения в экспрессии генов, подобно экспрессии генов в молодой коже.
1 Chang A, Bitter P, et al. (2012) Journal of Investigative Dermatology advance online publication 30 August 2012; doi: 10.1038.jid.2012.187.
Исследования, проводимые на моделях организмов, предполагают, что стареющие клетки могут быть функционально омоложены. Возможно ли применить эту концепцию к коже человека?
До сих пор это оставалось недоказанным.
В нашем организме порядка 30 000 генов, не так много, как можно было бы предположить. Из них за качество кожи отвечают чуть более 2000 генов. Предлагаем вам ознакомиться с результатами уникального исследования, в ходе которого изучались генные изменения, происходящие вследствие фотостарения и естественного старения (хроностарения) кожи человека, а также влияние процедур широкополосного света (BBL) на эти процессы. Оказалось, что старение кожи ассоциировано со значительными изменениями в РНК и, что процедуры BBL способны их «омолаживать», то есть делать более сходными по экспрессии с генами клеток молодой кожи. Таким образом, процедура BBL может восстанавливать экспрессию генов в клетках с фото- и хронологическим старением кожи человека, подобно клеткам молодой кожи.
Введение
Старение является комплексным процессом сложных генетических изменений и влияния окружающей среды и связано с множественными изменениями экспрессии генов в процессе жизни. На наш организм влияют множественные факторы, запуская экспрессию тех или иных генов. Но каким именно образом изменения на генном уровне сказываются на здоровье человека, до сих пор неизвестно. Многочисленные мутации единичных генов показывают продление жизни в моделях организмов (Partridge, 2010; de Magalhaes и соавт., 2012). Ограничения в диете также могут замедлять скорость старения, даже если начинают использоваться в конце жизни (Partridge, 2010). Так например, недавно Питер Нобл (Peter Noble) и Алекс Пожитков (Alex Pozhitkov) из университета Вашингтона в Сиэтле изучили генную экспрессию после смерти у мышей и рыбок и обнаружили, что многие гены продолжают работать после смерти. Более того, через 24-36 часов после того, как организм умирает, начинается экспрессия ранее неактивных генов.
Посмертно продолжается транскрипция более тысячи генов, отвечающих за воспалительные процессы, иммунитет, апоптоз (запрограммированную гибель клеток), клеточный транспорт, эмбриональное развитие, эпигенетическое регулирование и рак. Полностью их экспрессия прекращаются только через 96 часов после смерти.
Так же Совсем недавно в нескольких выступлениях было показано омоложение стареющих клеток или тканей, демонстрирующих удивительную обратимость процессов старения. Например, при гетерохронном парабиозе молодых и старых мышей высвобождаются циркуляторные факторы, которые восстанавливают функции стареющих стволовых клеток мышц (Liu and Rando, 2011). Кроме того, блокирование фактора транскрипции NF-kB в старых клетках эпидермиса мышей может прерывать клеточное старение и восстанавливать общую экспрессию генов клеток старой кожи, делая их подобными молодым клеткам (Adler et al., 2007).
Возникает вопрос: обладают ли такой же обратимостью процессы старения в коже человека, которые развиваются в течение десятилетий, а не месяцев или лет, как было показано на моделях мышей? Выявление прикладных методов блокирования процессов старения является серьезным вызовом.
Широкополосный свет (BBL), известный также как широкополосный импульсный свет, — общедоступная и популярная процедура «омоложения» кожи, является идеальной технологией для тестирования этой концепции. Согласно данным Американского общества эстетической и пластической хирургии (ASAPS), в 2009 году только в США на эти процедуры было потрачено более 215 млн долларов. В отличие от абляционных процедур, улучшающих состояние кожи за счет термической деструкции и запуска процесса регенерации эпидермиса и поверхностного слоя дермы, BBL использует широкополосный некогерентный свет в диапазоне от 400
до 1200 нм, который поглощается многими хромофорами в кожи.
В настоящее время процедуры BBL используются для уменьшения выраженности морщин, при нарушении пигментации, при эритеме и эластозе (Bitter Jr, 2000; Negishi et al., 2001). Однако ранее исследование результатов воздействия этого света не выходило за пределы гистологического анализа.
Термин «омоложение» используется как исследователями, так и обывателями, однако давайте попробуем разобратся с определением. В данном исследовании мы трактуем понятие «омоложение» как восстановление показателей молодости в стареющих клетках и тканях. Действительно ли после процедуры BBL кожа омолаживается на генном уровне и становится подобной молодой коже или же происходящие изменения связаны с раневыми процессами и запуском процессов регенерации, что фундаментально отличается от молодой неповрежденной кожи?
Гистологические исследования подтверждают, что BBL достоверно снижает содержание меланина в дерме и устраняет телеангиэктазии (Bitter Jr, 2000; Prieto и соавт., 2002). Также в нескольких исследованиях сообщалось об увеличении содержания коллагена в верхних слоях сосочковой дермы к третьей неделе после процедуры (Negishi et al., 2001). Однако синтез нового коллагена может носить изменчивый или краткосрочный эффект: данные ультразвукового анализа кожи через 3 месяца после процедуры не показали признаков влияния на коллаген и эластин (Prieto et al., 2002).
Мы изучили молекулярные основы ответа на процедуры BBL, определяя общую экспрессию генов кожи человека с фотостарением и хронологическим старением после процедур BBL. Целью являлось проанализировать широкий спектр изменений в РНК стареющих клеток при воздействии BBL, включая изменения экспрессии генов (кодируемых и некодируемых) и регуляцию генов.
Участники исследования и материалы
Данное исследование проведено в соответствии с Хельсинской декларацией. После ознакомления и подписания информированного согласия пяти женщинам участницам в возрасте старше 50 лет провели процедуры BBL на левом предплечье. Критериями выбора в качестве исследуемого были тип кожи II или III по Фитцпатрику и умеренная или выраженная степень фотоповреждения и старения кожи на предплечье (McKenzie и соавт., 2010).
Посещение соляриев, местное нанесение ретиноидов и проведение любых процедур на коже рук было запрещено за 1 месяц до начала и в течение всего исследования. Участники были проинструктированы защищать свои руки с помощью солнцезащитных кремов широкого спектра и одежды с длинными рукавами, а также избегать контакта с солнцем.
Процедура проводилась на платформе Joule компании Sciton с использованием модуля BBL. Участникам проводили 3 процедуры с интервалом 4 недели с использованием фильтров 515 или 560 нм одним импульсом длительностью 10-20 мс с удельной мощностью 8-14 Дж/см.
Во время одной процедуры выполнялись два или более прохода. Через 4 недели после 3-й процедуры BBL проводилась Punch-биопсия участков кожи размером 4 мм на обработанной коже и на соседнем необработанном участке.
Также проводилась Punch-биопсия (4 мм) участков кожи, не подвергающихся воздействию солнечных лучей, у пяти участниц в возрасте до 30 лет, которые имели те же критерии включения в исследование, но не имели признаков фотостарения на руках.
Образцы были разделены пополам и помещены в раствор для стабилизации РНК или раствор формалина для окрашивания гемотоксилин-эозином.
Исследование генных изменений
ПЧтобы точно выявить признаки старения в окончаниях молекул РНК, мы вначале выявляли нарушения транскрипции участков генов, ассоциированных со старением путем сравнения образцов молодой кожи с образцами не леченной стареющей кожи, а затем тестировали, какое влияние оказывает процедура BBL на изменение этих показателей. Сравнение уровней транскрипции мРНК в молодой необработанной коже и стареющей необработанной коже, а также в стареющей необработанной и стареющей обработанной, показало значительное увеличение уровней экспрессии в 3 530 генах (рис. 2 а). Направленность изменения генов после процедуры BBL показана на рисунке 2 а: голубым отмечено двукратное уменьшение, а желтым — двукратное увеличение экспрессии. Для наглядного визуального отображения значимых генов мы использовали визуальную тепловую карту. Справа от нее мы расположили таблицу, пурпурные полосы которой отображают основные биологические эффекты, за которые отвечают гены, в соответствии с генной онтологией. Например, «омоложенные гены» и lncRNAs (длинные некодируемы РНК) расположены в обеих верхних и нижних частях визуальной тепловой карты. Гены, отвечающие за иммунный ответ и трансляцию, расположены в нижней половине карты. Гены, отвечающие за клеточную адгезию, расположены в верхней части карты. Активность этих генов снижена в группе молодых волонтеров и увеличена в группе возрастных волонтеров, а в группе тех же волонтеров со стареющей кожей, прошедших процедуру BBL активность генов адгезии находится на среднем уровне. Соседняя таблица с пурпурными столбцам указывает на то, в каких генах происходят изменения и за какие биологические процессы отвечают эти гены. Визуальная тепловая карта при помощи «теплых» (желтый, повышение) и «холодных» (синий, снижение) цветов указывает направленность изменения активности генов — увеличение или снижение их функции, что позволяет сравнивать молодую кожу, стареющую не обработанную и стареющую обработанную кожу. Например, молодая кожа и обработанная старая кожа показывают увеличение уровней транскрипции, отвечающих за «иммунный ответ» и «трансляцию», поскольку обе эти группы показали увеличение активности генов (желтый цвет). И наоборот: в группе пациентов со стареющей кожей, до прохождения процедур происходит снижение активности генов (синий) «иммунного ответа» и «трансляции» в сравнении с двумя другими группами. Генные изменения, связанные со старением, многогранны и объединяют в себе изменения нескольких биологических функций.
Первая пятерка наиболее выраженных изменений с повышением активности генов стареющей кожи, в сравнении с молодой кожей, включает:
трансляция (Р = 4,7×10-12);
трансляционное удлинение (Р = 5,1×10-7);
трансляционное удлинение (Р = 5,1×10-7); ); макромолекулярные сложные комплексы (Р = 7,5 х 10-6);
нкРНК (не кодируемые РНК), отвечающие за метаболизм (Р = 6,2 х 10-6);
РНК процессинг (Р = 2,5х10-6).
Первая пятерка генов со снижением функции в группе стареющей н кожи, до прохождения процедур BBL в сравнении с молодой кожей, включала:
гены, отвечающие за клеточную адгезию (Р = 1,5×10-17);
биологическая адгезия (Р = 1,5×10-17);
гомофильная клеточная адгезия (Р = 7,8×10-8);
ген, отвечающий за развитие скелета (Р = 3,2×10-7);
энзим-связанный белок-рецептор сигнального пути (Р = 5,2×10-6).
Изменения в этих генах напоминают изменения набора генов при старении в других тканях и организмах.
BBL изменяет экспрессию генов
Гены, уровень экспрессии которых в стареющей коже, обработанной BBL, был ближе к генам молодой кожи, были обозначены RGs («омоложенные гены»). Иерархическая кластеризация показала, что экспрессия генов обработанной стареющей кожи более сходна с молодой кожей, чем со стареющей кожей до воздействия BBL(рис. 2 а).
Омоложенные гены отвечают за сцепленные с ними определенные биологические функции,
шесть наиболее выраженных из них:
трансляция (P = 5,8×10-11);
РНК-процессинг (Р = 6,3×10-8);
нкРНК процессинга метаболизма (Р = 1,4×10-7);
регуляция клеточного метаболизма белка (Р = 1,6×10-5);
макромолекулярные катаболические процессы (Р = 2,1×10-5);
клеточный цикл (Р = 2,4×10-5) (рис. 2b, справа вверху).
Более детальное исследование показало экспрессию «омоложенных» процедурой BBL генов, связанных с ключевыми регуляторами, известными, как гены, контролирующие старение (рис. 2с).
Они включают:
ZMPSTE24 — металлопротеиназу, которая перерабатывает ламин А. Дефект этого гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения, прогерию Хатчинсона-Гилфорда.
Рецептор IGF1R — этот ген непосредственно связан со старением и долгожительством в моделях человека, мышей и других организмов (Liang et al., 2011; Tazearslan et al., 2011).
Другие «омоложенные гены» — EIF4G1 и EIF4EBP1 — отвечают за повышение продолжительности жизни у Caenorhabditis elegans (свободноживущая нематода, которая широко используется как модельный организм) (Curran и Ruvkun, 2007).
MLL — регулятор транскрипции, связанный с теломерами (Caslini et al., 2009), и метилат H3K4, который отвечает за нормальную продолжительность жизни у C.elegans (Greer и соавт., 2010).
MAP3K5 (ASK10) — регулирует активность киназ в ответ на оксидантный стресс в модели стареющих мышей Klotho (Hsieh и соавт., 2010).
PSMD8 — является компонентом протеасом, нарушение работы которых способствует старению кожи человека (Hwang и соавт., 2007).
RING1 и MOV10 — участвуют в процессах, контролирующих длительность жизни фибробластов человека (Itahana и соавт., 2003).
EEF2 (эукариотический фактор трансляции элонгации 2) — был также отнесен к «омоложенным генам». Согласно исследованиям, он связан со снижением синтеза белка у крыс (Parado и соавт., 1999).
Наконец, ряд генов-супрессоров, которые контролируют клеточный цикл и обеспечивают целостность генома, таких как ING4 супрессор опухоли, DAXX и MSH2, были также «омоложены».
Влияние процедуры BBL на иммунный ответ отражается в изменении показателей иммунного ответа, по сравнению с образцами молодой кожи. Рисунок 2 а показывает, что хотя гены, отвечающие за иммунный ответ, «повышают» активность после процедуры, этот профиль «повышения» больше напоминает молодую необработанную кожу. Это предполагает, что небольшая часть иммунного ответа, которая «повысилась» после процедуры, является частью «омоложения» и является неспецифическим ответом на процедуру BBL.
Таким образом, процедура BBL способна восстанавливать множество молекулярных свойств молодой кожи в стареющих клетках кожи человека, по меньшей мере, в краткосрочной перспективе. К тому же, мы не обнаружили изменений экспрессии генов, связанных процессами ранозаживления и рубцевания.
Специфический ответ на омоложение BBL
В дополнение к эффектам, связанным с экспрессией возраст-ассоциированных генов, мы также рассмотрели возможность того, что процедура BBL может оказывать специфическое лечебное действие, не связанное со старением. Например, что процедура BBL могла бы стимулировать процессы заживления ран или рубцеобразования, в дополнение к омолаживающему действию. Мы выявили существенные изменения экспрессии 1 112 генов, которые наблюдались только в образцах, прошедших процедуру BBL, но этих изменений не было выявлено в образцах не молодой и не обработанной стареющей кожи.
Среди этих генов со специфическим ответом на процедуру пять наиболее выраженных биологических эффектов с увеличением экспрессии генов после процедуры были:
иммунный ответ (Р = 3,8×10-12);
положительная регуляция иммунной системы (Р = 2,0×10-8);
активация клеток (Р = 5,7×10-8);
активации Т-клеток (Р = 6,0×10-7);
защитные реакции (Р = 1,4×10-7).
Эти реакции связаны с иммунным ответом на BBL и отличаются от иммунного ответа генов, которые также увеличивались у молодых. Пятью наиболее значимыми биологическими эффектами, связанными со снижением экспрессии генов после процедуры, были:
регуляция транскрипции (Р = 2,0×10-6);
транскрипция (Р = 1,7×10-5);
ответ на органические вещества (Р = 1,1×10-4);
ответ на гормональные стимулы (Р = 4,4×10-4);
отрицателная регуляция транскрипции (Р=4,7×10-4).
Эти гены отличаются от предварительно описанных эффектов на «заживление», которые характеризуют ответ процессы заживления кожи (Chang и соавт., 2005); однако сложно сделать прямое сравнение, поскольку нет описанных в литературе эквивалентных нашим данным по активности генов, связанных раневыми процессами на 4-ю неделю.
И наконец, топ-10 генов, повышающих активность и снижающих активность у леченных BBL со стареющей кожей в сравнении с не обработанной стареющей кожей приведены в таблице 1.
Дискуссия
Полученные нами результаты показывают, что регуляторы старения организма могут быть изменены в коже человека, благодаря использованию технологии BBL. Насколько пластичны процессы старения и насколько они могут изменяться в сторону оздоровления кожи, еще предстоит выяснить.
Хотя фотоомоложение BBL используется больше с эстетической целью для придания коже внешне «молодого» вида, наше исследование показало, что наблюдается омоложение кожи на молекулярном уровне, с многочисленными изменениями в работе генов, связанных с процессами старения. Что видимые клинические изменения обусловлены функциональным омоложением кожи (как минимум на короткий период времени), а не внешней косметической имитацией вида молодой кожи.
Поскольку фотоомоложение BBL существует менее 20 лет, долгосрочные эффекты BBL-терапии еще предстоит определить. Хотя в данном исследовании оценивали состояние кожи через 4 недели после процедуры, неясно, как долго сохраняется этот клинический эффект и молекулярные изменения. Неизвестно также, насколько стойко сохраняется эффект у таких связанных с возрастом состояний, как себорейный кератоз или актинический кератоз со временем. Может быть информативным исследовать нынешних участников в долгосрочной перспективе с фотографированием и биопсией кожи, чтобы определить длительность клинического, гистологического и молекулярного эффекта процедуры BBL.
Точные механизмы, при помощи которых BBL (некогерентное световое излучение) изменяет экспрессию генов, на данный момент хорошо не изучены. Например, известно, каким образом BBL поглощается различными мишенями — меланином и гемоглобином, что приводит к уменьшению эритемы и пигментации.
Это предварительное исследование, и мы будем изучать влияние BBL на молодую кожу. В данном исследовании мы не проводили процедур BBL на молодой коже (у лиц в возрасте моложе 30 лет), поскольку они не имели клинических показаний; эти лица не имели различимых признаков фотостарения и хроностарения кожи предплечий. Поскольку маловероятно, что BBL будет использоваться на практике на молодой коже без признаков фотостарения (за исключением удаления волос), мы не включили эту группу в исследование.
Данные о возможном влиянии BBL на синтез коллагена противоречивы, согласно доступным источникам. Хотя некоторые доклады указывают на гистологические изменения, индуцированные процедурой BBL, включая неогенез коллагена (Negishi и соавт., 2001), в других исследованиях этих изменений не отмечается (Prieto и соавт., 2002). Согласно данным последнего исследования, не отмечено также изменений в содержании эластина после процедуры. В нашем исследовании не было отмечено существенных изменений в содержании коллагена после процедуры на окрашенных по PAS образцах. Они имели снижение количества эластина на препаратах, окрашенных по von Giesen. Мы не обнаружили существенных изменений уровней экспрессии генов коллагена и эластина после процедуры. Возможно, причина заключается в одном заборе материалов для тестов, что могло не захватить промежуток времени, когда уровень экспрессии генов коллагена и эластина претерпевал существенные изменения. Последующие исследования с биопсией кожи позволят выявить динамику процессов активации/супрессии генов-мишеней. Кроме того, целью данного исследования было выйти за рамки простого гистологического анализа кожи и изучить молекулярные изменения при старении кожи и влияние на них процедур BBL. Мы исследовали множество изменений в генах соединительной ткани, которые могут модулироваться BBL.
Последующие исследования с большими выборками могут позволить нам выявить дополнительные значимые гены (как кодируемые, так и не кодируемые), экспрессия которых изменяется в сравнении со стареющей не обработанной кожей с молодой не обработанной кожей, а также не обработанной стареющей кожей собработанной стареющей кожей. Большие выборки могут позволить соотнести степень клинического ответа с изменениями в «омоложенных» генах.
